内因性 TRPC による in vitro および in vivo でのワイヤレス神経調節

Communications Biology volume 5、記事番号: 1166 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

DBS の侵襲性を最小限に抑えるために、さまざまな磁気深部脳刺激 (DBS) 方法が過去 10 年間で急速に開発されてきました。 しかし、磁気熱刺激や磁気機械刺激などの現在の磁気 DBS 法では、中枢神経系 (CNS) における外因性イオンチャネルの過剰発現が必要です。 磁気機械的刺激が非トランスジェニックCNSニューロンを調節できるかどうかは不明である。 今回、我々は、弱くて遅い交番磁場（10 Hzで50 mT）を伴う磁性ナノディスクのトルクが、脳内に広く発現する機械感受性イオンチャネルである固有一過性受容体電位標準チャネル（TRPC）を介してニューロンを活性化できることを明らかにした。 c-fos による免疫染色は、in vivo での磁気機械的アプローチによるワイヤレス DBS によるニューロン活動の増加を示します。 全体として、この研究は、インプラントや遺伝子操作を行わずに、in vitro でのワイヤレスニューロン刺激や in vivo でのアンテザード DBS に使用できる磁性ナノディスクベースの磁気機械的アプローチを実証しています。

従来の脳深部電気刺激（DBS）は、神経障害、特にパーキンソン病、本態性振戦、その他の疾患などの運動障害の治療に使用されてきました1。 ただし、電気刺激を使用するには、脳深部に電極を侵襲的に慢性的に埋め込む必要があります2。 DBS の侵襲性を最小限に抑えるために、光学 3、音響 4、および電磁 5 ニューロン変調アプローチを含む蓄積アプローチが開発されました。 光遺伝学では、光を使用して標的細胞型のオプシンを活性化していました。 しかし、光は生体組織によって容易に散乱され、吸収される可能性があります。 深部組織に光を届けるためには、光ファイバーの埋め込みが必要です。 ソノジェネティクスや集束超音波刺激などの超音波による音響アプローチは、ハードウェア インプラントを使用せずにニューロンの活動を調節できます。 しかし、超音波は頭蓋骨や骨によって散乱、反射、歪む可能性があります。 さらに、音響神経刺激では、頭蓋水窓を備えた超音波プローブの取り付けが必要です。 すべての物理的アプローチの中で、磁場だけが吸収や散乱なしに脳に浸透することができます6。 経頭蓋磁気刺激 (TMS) は、強力な磁場 (>1 T) を使用して脳内に電流を誘導する、非侵襲的な神経刺激アプローチです。 TMS で使用される強力な磁場は、筋肉のけいれん、顔面の痛み、その他の不快感などの望ましくない副作用を引き起こす可能性があります7。 TMS の臨床応用は皮質刺激に限定されており、DBS には使用できません。 過去 10 年間、ワイヤレス磁気 DBS に弱い磁場を使用することは、磁性ナノ粒子ベースのニューロン変調手法を使用することによって達成されました 8、9、10、11、12、13。

高周波（100 kHz ～ 1 MHz）の交流磁場の適用によるヒステリシス電力損失を介して磁性ナノ粒子から放散される熱は、磁気熱遺伝学で使用されました9。 磁気熱刺激によってニューロンの活動を操作するために、温度感受性カチオン チャネル、一過性受容体電位バニロイド 1 (TRPV1)、または温度感受性アニオン チャネル、アノクタミン 1 を標的ニューロンで過剰発現させました 9、10、13。 磁気熱遺伝学を備えたワイヤレス DBS は、生体内で自由に移動するマウスで実証されています。 磁気熱発生学を利用した視床下核 (STN) の磁気 DBS は、パーキンソン病マウスの異常行動を救済する可能性があります 13。 最近、別の磁気アプローチである磁気機械刺激が、末梢神経系 (PNS) と中枢神経系 (CNS) の両方で実証されました。 このアプローチでは、弱くて遅い磁場中の磁性ナノ粒子または磁性ナノディスクのトルクからの機械的な力を使用して、ワイヤレスでニューロンの活動を刺激します。 PNS では、機械感受性イオン チャネル、Piezo1/2 および TRPV4 が感覚ニューロンで高度に発現しています 14。 研究では、弱くゆっくりと変化する磁場（5 Hz で 25 mT 未満）における約 250 nm の磁性ナノディスクのトルクが、一次後根神経節（DRG）の機械感受性ニューロンの Ca2+ 応答を誘発する可能性があることが示されました 11。 PNS とは対照的に、CNS ニューロンにおける Piezo1/2 の発現レベルは非常に低いです。 磁気機械遺伝学では、Piezo1 が脳内の標的ニューロンで過剰発現されました。 これらの Piezo1 発現ニューロンは、0.5 Hz、20 mT の磁場を伴う 500 nm の磁性ナノ粒子のトルクによって刺激される可能性があります 12。 しかし、磁気熱遺伝学と磁気機械遺伝学の両方において、外来遺伝子の過剰発現による潜在的な副作用は依然として不明です。 臨床応用における遺伝子送達用のウイルスベクターも安全性への懸念を引き起こしました 15,16。 したがって、この研究では、遺伝子送達の必要性を排除する非遺伝的アプローチを開発しました。

標準一過性受容体電位 (TRPC) は、さまざまな脳領域にわたって高度に発現される非選択的カチオン チャネル ファミリーです。 TRPC1/4/5、TRPC2、および TRPC3/6/7 の 3 つのサブグループがあります。 それらの中で、哺乳類の TRPC1、5、および 6 は機械感受性があり、伸張刺激応答において役割を果たしています 17、18、19。 TRPC は、ニューロンの発達、学習、記憶、恐怖関連行動 22、24 など、生理学的状態と病理学的状態の両方でニューロンにおいて複数の機能的役割を果たしています 20、21、22、23。 TRPC は、パーキンソン病 25、ハンチントン病 26、虚血性脳卒中 27 などのさまざまな神経疾患に関与しています。 Piezo1/2 と比較して、TRPC は作動させるためにより大きな機械力を必要とします28。 磁気機械的刺激が固有の TRPC を活性化できるかどうかは不明です。 この研究では、内因性 TRPC 媒介ニューロン応答は、以前の研究で外因性 Piezo1 を活性化するために使用された刺激よりもわずかに強い磁気機械的刺激によって引き起こされる可能性があるという仮説を立てています 11,12。 これは、in vitro および in vivo でのニューロンの調節に使用できます (図 1a)。 機械的な力をニューロンに変換するために、この研究では前述のマグネタイト (Fe3O4) ナノディスク (MND) が使用されました 11。 磁場が存在しない場合、MND の渦状態は溶液中でより優れたコロイド安定性を示しました。 低周波数の弱い磁場では、MND のトルクによって生成される機械的な力が細胞膜上の機械感受性イオン チャネルを活性化する可能性があります 11。

a MND を使用した磁気機械刺激の概略図。 反応の最初のステップで反応溶液に 6% H2O を加えた場合の PMAO コーティングされた MND (b) および HND (c) の TEM 画像。 反応の最初のステップで反応溶液に 8% H2O を加えた場合の PMAO コーティングされた MND (d) および HND (e) の TEM 画像。 f TEM 画像から測定されたナノディスクの直径 (すべてのグループ、n = 10)。 g TEM 画像から測定されたナノディスクの厚さ (すべてのグループ、n = 10)。 直径と厚さの統計分析を表S1-3に示します。 h さまざまな条件からの MND と HND の XRD スペクトル。 i PMAO コーティングされた MND (n = 12) および HND (n = 9) のゼータ電位。 p = 0.917、マンホイットニー検定。 エラーバーは平均値 ± 標準誤差の平均値 (sem) を表します。

超常磁性マグネタイト ナノディスク (MND) は、磁気神経刺激用のナノトランスデューサーとして使用されました。 異方性マグネタイトナノディスクは、以前に説明した2ステップの合成プロトコル11によって合成されました（図S1a）。 最初のステップでは、非磁性ヘマタイト (α-Fe2O3) ナノディスク (HND) が、オートクレーブ反応器内で 180 °C でソルボサーマル法によって合成されました。 次に、同じサイズを維持しながら HND を縮小して MND を作成しました。 均一な HND および MND のサイズは、第 1 段階の反応溶液中の H2O の濃度によって調整できます (図 1b–e、S1b)。 HND の直径は 282.8 ± 10.2 nm および 221.0 ± 4.2 nm で、第 1 段階の反応ではそれぞれ 6% および 8% (v/v) H2O を使用しました。 最初の段階の反応で 6% および 8% (v/v) H2O を使用した場合、MND の直径はそれぞれ 280.0 ± 5.9 nm および 212.4 ± 7.0 nm でした (図 1f-g)。 同じ合成プロセスからのHNDとMNDのサイズと形状は類似していました（図1f、g、表S1–3）。 X線回折スペクトル（XRD）は、最初のステップで得られたHNDがMNDに完全に還元されたことを示しています（図1h）。 同様に、磁化曲線は、HNDが外部磁場の印加によって磁化できないことを示しています（図S1c）。 HND とは対照的に、MND は外部磁場によって磁化することができます。 VSM の結果から計算された MND の磁気モーメントは 8.7 × 10−16 Am2 です。 したがって、神経刺激における MND の機能を調べるために、非磁性 HND をネガティブ コントロール グループに使用しました。 以前の研究の計算によると、磁性ナノディスクが大きくなると、より大きな機械力が生成される可能性があります11。 したがって、非トランスジェニック野生型ニューロンの磁気機械的刺激には、より大きな直径（>250 nm）のナノディスクを使用しました（図1b、c）。 ナノディスクを機能化するために、神経刺激用のすべての MND と HND をポリ (無水マレイン酸-alt-1-オクタデセン) (PMAO) でコーティングしました 11。 負に帯電したナノ粒子は、興奮性ニューロン細胞へのナノディスクの付着を促進する可能性がある29。 PMAOでコーティングされたナノディスクのゼータ電位は、MNDの場合は-53.5±3.7 mV、HNDの場合は-54.5±2.3 mVでした（図1i）。 この研究では、PMAO コーティングされた MND と PMAO コーティングされた HND がそれぞれ磁気機械的ニューロン刺激とコントロール グループに使用されました。

次に、MND または HND (70 μg/ml) を初代海馬培養ニューロンに適用しました。 走査型電子顕微鏡（SEM）画像は、MNDとHNDの両方が一次海馬ニューロンの膜に付着していることを示しています（図2a、b）。 全細胞記録では、負に帯電したMNDおよびHNDがあるニューロンとないニューロンの間で静止膜電位の有意な差は観察されませんでした（図S2a〜d）。 グループ間の他の固有の特性にも有意な差はありませんでした（図S2e、f）。 蛍光顕微鏡用にカスタム設計された磁気装置を、正立顕微鏡下での磁気刺激に使用しました（図2c）。 有限要素法磁気​​学 (FEMM) シミュレーションでは、3 A の電流を印加してカスタム設計のコイルの中心内に均一な 50 mT の磁場が生成されました (図 2d、上)。 これは、2.8 A の電流で実際のコイルから測定された 50 mT に非常に似ています (図 2d、下)。 3 A の電流を 2 分間連続して印加しても、明らかな温度上昇 (ΔT = 0.20 ± 0.23 °C) は観察されませんでした。 神経活動はCa2+指示薬Fluo-4を用いて測定した。 初代培養ニューロンにMNDを適用すると、10 Hzで50 mTの磁気刺激がニューロンのCa 2 + 応答を誘導できることがわかりました（図2e、g、h）。 対照的に、同じ条件の磁場は、HNDを適用した対照グループではCa 2+ 応答を誘発できません（図2f〜h）。

培養ニューロンの膜上の MND (a) および HND (b) の SEM 画像。 c 蛍光顕微鏡用磁気装置の概略図。 右は特注コイルの寸法です。 d コイルによって生成される磁場のヒート マップ。 上、3 A 電流によるコイルの FEMM シミュレーション。 下は、3 A DC 電流を流したときのコイル内部の磁場を測定したものです。 MND (e) または HND (f) を適用したニューロンの蛍光強度のカラー マップ。 10Hzで50mTの磁場を30秒間印加した。 g 磁場刺激による Ca2+ 応答の平均トレース。 赤線、MND グループ (n = 19/3 (ニューロン/サンプル))。 黒線、HND グループ (n = 13/3)。 明部、sem h 異なるグループにおける Ca2+ 応答の最大変化 (MND、n = 19/3 (ニューロン/サンプル); HND、n = 13/3)。 ***p < 0.001、マン・ホイットニー検定。 1 Hz (i, n = 46/6 (ニューロン/サンプル))、5 Hz (j, n = 30/6)、10 Hz (k、 n = 19/6)、または 20 Hz (l、n = 18/6)。 各周波数において、磁場強度は 10 mT から 50 mT まで順次増加しました。 灰色の領域は sem です。色の領域は、10 (青)、20 (シアン)、30 (緑)、40 (ピンク)、および 50 mT (オレンジ) での磁気刺激の期間を示します。 m さまざまな条件での最大 ΔF/F0 (1 Hz、n = 46/6 (ニューロン/サンプル))。 5 Hz、n = 30/6; 10 Hz、n = 19/6; 20 Hz、n = 18/6。 F = 9.639、電界強度については p < 0.001、周波数については F = 6.155、p < 0.001。 周波数と強度の相互作用については、F = 1.459、p = 0.11。 二元配置分散分析。 ***p < 0.001、テューキー事後検定。 エラーバーは平均値±標準誤差を表す

固有のメカノセンサーによる磁気機械的刺激の最適な条件を特定するために、さまざまな周波数と磁場強度の磁場におけるニューロンの反応を比較しました。 1 ～ 20 Hz の代替磁場を使用して、MND (70 μg/ml) を含む培養ニューロンで Ca2+ 応答を誘導しました。 異なる周波数で、磁場の強度は10 mTから50 mTまで連続的に増加しました（図2i-l、S3）。 50 mT シミュレーションでの Ca2+ 応答は、10 ～ 40 mT の他の磁場強度よりも大幅に大きいことがわかりました (図 2m)。 5 ～ 20 Hz での Ca2+ 応答は、1 Hz での応答よりも有意に大きかった。 これらの結果は、MND のトルクが 50 mT の磁気刺激で​​ニューロン活動を引き起こすのに十分な大きさであることを示しています。

異なる周波数で50 mTでニューロンを刺激した場合（図3a〜d）、10および20 Hzの刺激は1および5 Hzの刺激よりも大きなCa 2+ 反応を誘導することがわかりました（図3e）。 10 Hzの刺激は、他の条件よりも多くの細胞集団を活性化することができました（図3f）。 対照的に、HNDを適用した磁気刺激は、あらゆる条件でニューロンに応答を誘発することはできません（図S4a）。 これらの結果は、磁気機械的刺激でニューロンを活性化するには、10 Hz で 50 mT が最適な条件であることを示しています。 さらに、磁気刺激を4回繰り返し適用すると、すべての周波数で培養ニューロンに複数のCa2+応答が観察されました（図3a〜d、S4）。 磁気刺激を 4 回繰り返した後、細胞生存率をヨウ化プロピジウムでテストしました。ヨウ化プロピジウムは、死んだ細胞の細胞膜にのみ浸透でき、生細胞には浸透できない小さな蛍光分子です 30。 MNDまたはHNDで処理したニューロンのいずれにおいても、異なる周波数での刺激後の細胞死は観察されませんでした。 (図3g、h)。

1 Hz (a、n = 32/6 (ニューロン/サンプル))、5 Hz (b、n = 51/6)、10 Hz (c、n = 52/6)、または 20 Hz で 50 mT の複数刺激(d、n = 34/6)。 上、個々のニューロンにおける Ca2+ 応答のヒートマップ。 白い破線の下の細胞は刺激中に活性化されました。 下、蛍光変化の平均トレース。 明るいオレンジ色の領域は、磁気刺激の期間を示します。 赤い線、MND グループ。 黒線、HNDグループ。 ピンクとグレーの領域、サンプル さまざまな周波数での蛍光の最大変化 (1 Hz、n = 32/6 (ニューロン/サンプル)、5 Hz、n = 51/6、10 Hz、n = 52/6、20 Hz、 n = 34/6)。 F = 1.050、p < 0.001、クラスカル-ウォリス検定。 f さまざまな周波数での各培養サンプルの細胞活性率 (すべてのグループ、n = 6)。 F = 8.208、p < 0.001、クラスカル-ウォリス検定。 *p < 0.05、***p < 0.001、ダン事後検定。 g 10 Hzでの磁気機械刺激後のMNDを有するニューロンにおけるPI処理。 緑色、Fluo-4; レッド、PI。 h 異なる周波数の刺激による生死アッセイの定量化 (すべてのグループ、n = 6)。 周波数については F = 0.003、p = 0.995。 ナノディスクの種類については F = 0.003、p = 0.862。 周波数とナノディスク間の相互作用については F = 0.022、p = 0.995、二元配置分散分析。 エラーバーは平均値±標準誤差を表す

哺乳動物細胞にはいくつかの機械感知陽イオンチャネルが発現しています。 Piezo1/2、TRPC、TRPV4、ASIC331、32を含む。 このうち、TRPC と TRPV4 は CNS31 で報告されています。 対照的に、Piezo1/2 と ASIC3 は主に PNS32 で発現されます。 MND 媒介応答のメカニズムを調査するために、薬理学的アプローチを使用して、海馬ニューロンの磁気刺激応答に関与するイオン チャネルを分析しました。 TRPC サブファミリーでは、TRPC1、5、および 6 が機械感受性カチオン チャネルとして報告されています 17、18。 我々は、TPRCサブファミリーに対する特異的ブロッカーであるSKF-96365（50μM）が、磁気機械的に誘発されたCa2+応答を排除することを発見した（図4a、e、f、S5a、b）。 さらに、GsMTx4、d-GsMTx4 (5 μM)、2-アミノエトキシジフェニルボレート (2-APB) などの他の非特異的 TRPC ブロッカーも TRPC の寄与を調べるために使用されました。 GsMTx4 と d-GsMTx4 は、それぞれ Piezo1 と Piezo2 のアンタゴニストです。 これらは、TRPC1、5、および 619 のアンタゴニストでもあります。2-APB は、TRPC アンタゴニストおよび TRPV1-3 アゴニストですが、TRPV433 には非感受性です。 SKF-96365と同様に、GsMTx4（5μM）、d-GsMTx4（5μM）、2-APB（100μM）を含むすべてのTRPCブロッカーは、海馬ニューロンにおける磁気機械的に誘発された反応を排除することができました（図1）。 4b–f、S5a、b)。 これらの結果は、海馬ニューロンにおける固有の TRPC が磁気機械的刺激において重要な役割を果たしていることを示しています。

50μMのSKF-96365（a、n = 26/6（ニューロン/サンプル））、5μMのGsMTx4（b、n = 19/6）、d-GsMTx4のバスアプリケーションによる複数の磁気機械刺激によるCa2+応答。 5 μM (c、n = 19/6)、および 100 μM の 2-APB (d、n = 36/6)。 磁気刺激は 50 mT、10 Hz で 30 秒間です。 刺激間の間隔は 60 秒です。 上、個々の細胞の応答のヒートマップ。 白い破線の下の細胞は刺激中に活性化されました。 下は平均した蛍光変化。 明るいオレンジ色の領域は、磁気刺激の期間を示します。 灰色の領域は、最初の磁気刺激における、さまざまな TRPC ブロッカーで処理された MND 処理ニューロンの最大蛍光変化です (コントロール、n = 52/6 (ニューロン/サンプル)、SKF-96365、n = 26/6、GsMTx4、n = 19/6; d-GsMTx4、n = 19/6; 2-APB、n = 36/6)。 F = 146.799、p < 0.001、クラスカル-ウォリス検定。 f 最初の磁気刺激時にさまざまな TRPC ブロッカーでニューロンを処理した MND の細胞活動率 (すべてのグループ、n = 6)。 F = 29.017、p < 0.001、クラスカル-ウォリス検定。 **p < 0.01、***p < 0.001、対照群と比較。 ダン事後テスト。 エラーバーは平均値±標準誤差を表す

次に、海馬ニューロンの磁気機械的刺激における別の機械感受性イオンチャネルである TRPV4 の役割を、TRPV4 特異的ブロッカー HC-06704711 を適用することによって調査しました。 HC-067047（1μM）はMND媒介応答を調節できないことがわかりました（図5a、f、g、S5c、d）。 これは、磁気刺激応答が TRPV4 によって媒介されなかったことを示しています。 電位依存性ナトリウム チャネル (VGSC) ブロッカーであるテトロド​​トキシン (TTX; 100 nM) を、磁気機械的に誘導された Ca2+ 応答に活動電位が関与しているかどうかを調べるために使用しました。 最初の刺激は Ca2+ 反応を誘導し、TTX の適用により細胞活性はほぼ除去されます (図 5b、f、g)。 この結果は、磁気機械的に刺激された TRPC 活性化がニューロンの活動電位を誘導できることを示しています。 興味深いことに、複数の刺激の最大蛍光変化と細胞活性比は、TTX適用によって大幅に減少しましたが、完全には廃止されませんでした（図S5c、d）。 これらの TTX 非依存性 Ca2+ 応答は、他の活動電位非依存性 Ca2+ チャネルによって寄与される可能性があります。 TRPC は、Ca2+ 透過性を持つ非特異的陽イオンチャネルとして知られています。 TTX 非依存性 Ca2+ 応答は、TRPC 単独または他の電位依存性 Ca2+ チャネル (VGCC) によって寄与される可能性があります。 すべての VGCC の中で、T 型 VGCC と L 型 VGCC の CaV1.3 は、低閾値活性化イオン チャネルです。 VGCC が磁気機械的刺激応答に関与しているかどうかを調べるために、複数の磁気機械的刺激中に L 型および T 型 VGCC のアンタゴニストを適用しました。 ニフェジピンおよびミベフラジルは、一般に、それぞれ特異的 L 型 VGCC アンタゴニストおよび特異的 T 型 VGCC アンタゴニストと呼ばれます。 しかし、蓄積されている証拠は、それらがL型とT型の両方のVGCC34を遮断できる非特異的アンタゴニストであることを示しています。 ニフェジピン (10 μM)35 を使用すると、複数の磁気刺激による Ca2+ 応答はほとんどなくなりました (図 5c、f、g、S5c、d)。 同様に、ミベフラジル (3 μM)36 の適用により、複数の磁気刺激による Ca2+ 応答が大幅に減少しました (図 5d、f、g、S5c、d)。 これらの結果は、磁気機械的に誘発された TRPC 活性化が VGCC を引き起こす可能性があることを示しています。 TTX 非依存性 Ca2+ 応答は、TRPC のみを介した Ca2+ 流入によって寄与されない可能性があります。 最後に、Ca2+を含まない細胞外溶液を使用すると、磁気機械的に誘発されたCa2+応答はすべて排除されました（図5e〜g、S5c、d）。 これらの結果は、これらの Ca2+ 応答が外部溶液からの Ca2+ 流入によって寄与されたことを示しています（図 5h）。 全体として、薬理学的研究から、代替磁場によって生成される MND のトルクが外部溶液からの Ca2+ 流入を誘発する可能性があることがわかりました。 これらは主に培養ニューロンの VGCC と活動電位によって引き起こされました。 SKF-96365、GsMTx4、d-GsMTx4の実験は、この磁気機械刺激応答が主に固有のTRPCによって媒介されたことを示しています（図4a〜f、S5a、b）。

1 μM の HC-067047 (a、n = 38/6 (ニューロン/サンプル))、100 nM の TTX (b、n = 44/6)、10 μM のニフェジピンの浴適用による複数の磁気機械的刺激による Ca2+ 応答(c、n = 107/6)、3 μM のミベフラジル (d、n = 50/7)、および Ca2+ フリー溶液 (e、n = 79/8)。 磁気刺激は 50 mT、10 Hz で 30 秒間です。 刺激間の間隔は 60 秒です。 上、個々の細胞の応答のヒートマップ。 白い破線の下の細胞は刺激中に活性化されました。 下は平均した蛍光変化。 明るいオレンジ色の領域は、磁気刺激の期間を示します。 灰色の領域は最初の磁気刺激時の最大蛍光変化 (コントロール、n = 52/6 (ニューロン/サンプル)、HC-067047、n = 38/6、TTX、n = 44/6、ニフェジピン、n) = 107/6; ミベフラジル、n = 50/7; Ca2+ フリー、n = 79/8)。 F = 135.911、p < 0.001、クラスカル-ウォリス検定。 g 最初の磁気刺激時の細胞活性率 (コントロール、n = 6; HC-067047、n = 6; TTX、n = 6; ニフェジピン、n = 6; ミベフラジル、n = 7; Ca2+ フリー、n = 8 ）。 F = 30.674、p < 0.001、クラスカル-ウォリス検定。 h MND媒介応答のメカニズムの概略図。 **p < 0.01、***p < 0.001、対照群と比較。 ##p < 0.01、###p < 0.001、HC-067047 グループと比較。 ダン事後テスト。 エラーバーは平均値±標準誤差を表す

視床下核（STN）は、パーキンソン病患者を治療するための電気刺激を伴う従来の DBS の臨床標的です 37。 免疫組織化学を使用することにより、TRPC1、5、および6を含むすべての機械感受性TRPCがマウスのSTNで発現していることが観察されました（図6a〜c）。 これらの結果は、ラットの STN における TRPC 発現に関する以前の報告と同様です 38。 インビボでのSTNにおけるDBSの磁気機械的ニューロン調節を調べるために、ナノディスク(1mg/mlの2μl)をマウスのSTNに片側注射した(図7a)。 注射の座標は、蛍光標識されたMNDを使用して確認されました（図S6a、b）。 注射後、蛍光標識されたMNDは少なくとも5日間は分解または代謝されませんでした（図S6c、d）。 無線ニューロン刺激の場合、PMAO でコーティングされた MND と蛍光のない HND が STN の同じ座標に注入されました。 注射後5〜7日で、ナノディスクを注射したマウスを、内径20cm、高さ25cmの大型の特注設計の磁気装置内に配置した(図7b)。 この磁気装置は、4 組のドライバーと電源によって制御される 4 つの円形コイル (内径 20 cm、外径 28 cm、高さ 5 cm) で構成されていました。 FEMM シミュレーションでは、10 A の電流が流れるコイルの中心の磁場が 50 mT であることが実証されました (図 7c)。 カスタムメイドのコイルの中心から測定された磁場は、10 A の電流印加で 50 mT でした (図 7d)。 10 A の電流を 2 分間印加したときのコイルの温度上昇は 1 °C 未満でした (壁面で ΔT = 0.70 ± 0.15 °C、中心で ΔT = 0.83 ± 0.14 °C)。 覚醒したマウスを、30秒オン-30秒オフのサイクルで10Hz、50mTの磁場で10分間刺激した(図7a、b)。 STNを注入したMNDにおける前初期遺伝子c-fosの発現は、対側STNよりも有意に大きいことがわかりました（図7e-g）。 対照的に、HNDを注射したマウスの同側STNと対側STNのc-fos発現には差はありませんでした（図7h、S7a-b）。 MNDを注射したマウスのSTNにおけるc-fos発現の同側/対側の比も、HNDを注射したグループよりも有意に高かった(図7i)。 内足足核 (EP) は、マウスの STN グルタミン酸作動性投射ニューロンの下流の 1 つです。 そして、それは人間の内部淡蒼球 (GPi) と相同です。 STNと同様に、MNDを注射したマウスの同側EPにおけるc-fos発現は、対側EPよりも有意に多かった(図7j、S7c、d)。 しかし、HNDを注射したマウスでは、EPにおけるc-fos発現の増加はありませんでした（図7k、S7e、f）。 MND注射マウスのEPにおけるc-fos発現の同側/対側比も、HND注射群よりも有意に高かった(図7l)。 以前の研究では、パーキンソン病のない健康な野生型マウスのSTNを片側刺激した場合、回転行動の結果は議論の余地がありました。 ここで、これらの条件で無線磁気刺激を与えた覚醒マウスでは明らかな回転行動は観察されませんでした（図S8）。 c-fos 染色の結果は、MND を用いた磁気機械的アプローチを使用することにより、生体内で脳深部領域の神経回路を無線で調節できることを示しています。

NeuN (赤)、TRPC1 (緑)、DAPI (青) の免疫染色と STN のマージ画像。 挿入図、ニューロンの拡大結合画像。 b NeuN (赤)、TRPC5 (緑)、DAPI (青) の免疫染色、および STN のマージ画像。 挿入図、ニューロンの拡大結合画像。 c NeuN (赤)、TRPC6 (緑)、DAPI (青) の免疫染色および STN のマージ画像。 挿入図、ニューロンの拡大結合画像。

in vivoにおけるSTNでの磁気機械的刺激の概略図。 ナノディスクを一方的に STN に注入しました。 下、定位注射、磁気刺激、および c-fos 染色のタイムライン b 生体内での磁気機械刺激のためのワイヤレス磁気刺激装置の概略図。 下、磁気刺激のタイムライン。 c 10 Aの電流による生体内磁気装置のFEMMシミュレーション。 黒い線はマウスのシリンダーチャンバーを示します。 d 白い破線からの磁場の測定は、c の領域を示します。 NeuN (赤)、c-fos (緑)、DAPI (青) の免疫染色、および MND を注射したマウスの同側 STN (e) と対側 STN (f) からの合成画像。 g MNDを注射したマウスにおけるSTNのc-fos/NeuN (n = 9)。 h HND を注射したマウスにおける STN の c-fos/NeuN (n = 7)。 i ナノディスクを注射したマウスにおける同側STNと対側STNの間のc-fos/NeuNの違い。 MNDを注射したマウスにおけるEPのj c-fos/NeuN (n = 9)。 HND を注射したマウスにおける EP の k c-fos/NeuN (n = 7)。 l ナノディスクを注射したマウスにおける同側EPと対側EPの間のc-fos/NeuNの差。 **p < 0.01、***p < 0.001、ns、有意性なし。 (g)、(h)、(j)、(k) のペア データのウィルコクソン符号付き順位検定。 i と l の不対データのマン・ホイットニー検定。 エラーバーは平均値±標準誤差を表す

結論として、我々は、弱くて遅い交互磁場（10 Hzで50 mT）を印加すると、磁性ナノディスクによって生成される機械的力が、外来遺伝子を過剰発現させることなく野生型ニューロンの活動を誘導することを発見した。 我々は、これらの磁気機械的応答が主に固有の機械感受性カチオンチャネルであるTRPCによって媒介されていることを明らかにしました。 最後に、in vivo で覚醒マウスにおいて MND を介した磁気機械刺激によって脳深部領域の活動が増加しました。 Piezo1 発現 DRG または CNS における Piezo1 過剰発現における磁気機械的刺激に関する最近の研究では、1 ～ 5 Hz で <23 mT のみが必要です。 以前の報告と一致して、Piezo1/2またはTRPV4の過剰発現がないニューロンでは、40 mT未満の磁場による明らかな応答は観察されませんでした（図2i-m）。 私たちの研究におけるTRPC活性を誘導するための磁場強度は、以前の研究よりも大きい（50 mT）。 これは、TRPC には Piezo128 よりも強い機械力が必要であるという以前のレポートと一致しています。 しかし、MND で磁気機械的刺激を与える場合、TRPC が機械的刺激によって間接的に活性化される可能性を排除することはできません 39。

この研究のMNDとHNDはPMAOで官能化されており、負の表面電荷を帯びていました（図1i）。 以前の研究では、負に帯電したナノ粒子は興奮性ニューロン膜への粒子の付着を促進するが、非興奮性グリア膜への付着は促進しないことが示されている 11,29。 対照的に、正に帯電した、または中性のナノ粒子は神経細胞膜に付着できません 29。 神経膜の表面にある負に帯電したナノ粒子は興奮性を増加させる可能性がありますが 29、試験管内と生体内の両方で静止膜電位と神経活動の有意な増加は観察されませんでした。 まず、負に帯電したHNDを含む培養海馬ニューロンにはCa 2 + 応答がありません（図2e-h）。 全細胞記録では、MNDs処理ニューロンおよびHNDs処理ニューロンの静止膜電位は、ナノディスクを含まない対照グループよりも有意に高くはありませんでした（図S2a-c）。 最後に、c-fos免疫染色では、片側HNDを注射したマウスのSTNおよびその下流EPにおけるin vivoのニューロン活動は、同側半球と対側半球の間で差がありませんでした（図7h、k）。 それにもかかわらず、ナノディスクの表面を修飾することによって、標的ＴＲＰＣチャネルまたは標的ニューロンへのナノディスクの特異的付着を増加させるには、ナノディスクの表面をさらに修飾する必要がある。

光遺伝学、化学遺伝学、音遺伝学、磁気遺伝学など、最近開発されたアンテザード DBS 法のほとんどは、遺伝子ツールを使用して、標的の脳領域で外来遺伝子を過剰発現させています。 しかし、これらの方法で使用される遺伝的方法の規制障壁により、ヒト患者におけるこれらの DBS アプローチの翻訳応用は制限されます。 ここで実証された磁気機械的 DBS アプローチは、遺伝子導入にウイルスベクターを使用する安全性の懸念がない、トランスジーンフリーのアプローチです。 この研究は、磁気機械的刺激による内因性TRPCの活性化を明らかにするだけでなく、機械力による内因性TRPCの活性化が活動電位を引き起こし、ニューロンのVGCCを活性化する可能性があることも明らかにしました（図4、5）。 TTX を使用すると、MND によって誘発される反応が大幅に減少しました。 そして、それは、MND がニューロンの活動電位を引き起こす可能性があることを示しています。 興味深いことに、ニューロンが複数の磁気機械的刺激によって刺激された場合、TTX 非依存性の Ca2+ 応答が残存していました。 これにより、より多くの Ca2+ 透過性イオンチャネルが動員される可能性があります。 T 型 VGCC や L 型 VGCC の CaV1.3 などの低閾値 VGCC は、海馬ニューロンの細胞体と樹状突起で高度に発現しています 40,41。 VGCC ブロッカーを使用することにより、これらの残りの磁気機械的に誘導された Ca2+ 応答が T 型および L 型 VGCC の活性化によって寄与されていることを発見しました。 しかし、TRPC を介した明らかな Ca2+ 流入は観察されませんでした。 TRPCファミリーはカルシウム透過性を持つカチオンチャネルですが。 Ca2+透過性は、TRPCヘテロマーのサブユニット組成に依存します。 TRPC1/5 や TRPC1/6 などのヘテロマー TRPC の Ca2+ 透過性は、TRPC1 サブユニットによって低下する可能性があります 42,43。 TRPC1、5、および6サブユニットを含むヘテロマーTRPCは、海馬およびSTNで高度に発現されます。 どの TRPC サブユニット組成が磁気機械的刺激に関連しているかを理解するには、さらなる調査が必要です。 標的の脳領域および標的細胞型における TRPC サブユニットの発現を理解することも、将来の応用にとって重要です。

パーキンソン病では、STN の DBS が異常行動を救うことができます1。 しかし、健康な WT マウスでは、STN における動物の行動と DBS との関係は不明です。 研究では、光遺伝学による STN の活性化が WT マウスの同側回転を引き起こす可能性があることが示されています 44。 対照的に、別の研究では、磁気熱発生学で STN を刺激すると、WT マウスの対側回転が増加することが示されています 13。 これらの研究は、パーキンソン病のないマウスにおける STN での DBS の非常に物議を醸す結果を示しています。 これらの物議を醸す発見の違いは、神経調節方法と刺激強度に関連している可能性があります。 この研究では、MNDを注射したマウスの回転挙動は、覚醒マウスのSTNでMNDを介した磁気機械的DBSによって変化しません。 それにもかかわらず、c-fos の免疫染色により、ワイヤレス磁気機械 DBS を備えた WT マウスのニューロン活動の増加が見つかりました。 私たちの研究は、生体内でのワイヤレス刺激ニューロン活動の概念実証を示しています。 生体内での磁気機械的刺激のパラメーターを最適化するには、さらなる研究が必要です。 TRPC の制御は、パーキンソン病 25 および虚血性脳卒中 27 の治療のために以前に提案されています。 残念ながら、ほとんどの脳領域における TRPC の機能的役割は十分に特徴づけられていません。 将来の応用のためには、さまざまな脳領域および細胞型における TRPC の機能的役割の違いを考慮する必要があります。 パーキンソン病やその他の神経疾患における磁気機械刺激の潜在的な応用を見つけるには、さらなるトランスレーショナル研究が必要です。

遺伝子ベースの神経調節アプローチ以外に、トランスジーンフリーのワイヤレス給電小型 DBS デバイスの中には、依然として脳深部領域へのミリメートルからセンチメートルスケールのハードウェアの埋め込みが必要なものもあります 45,46。 ナノスケールのトランスジーンフリーのニューロン調節では、ある研究では、140 Hzの200 mT DC磁場と6 mT AC磁場による磁気刺激により、生体内で自由に移動するマウスのワイヤレスDBS用のコバルトフェライト-チタン酸バリウム圧電ナノ粒子を活性化できることが示されています47。 比較すると、この研究における磁気機械 DBS は、非常に低い周波数 (10 Hz) で 50 mT の弱い磁場のみを必要とします。 したがって、磁気機械的刺激の範囲内に均一な磁場を生成する磁気装置は、より大きな体積に拡張可能である。 この研究における in vitro および in vivo 実験用の特注コイルの内径は、それぞれ 3.5 cm および 20 cm でした (図 2c、7b)。 ほとんどの顕微鏡システムや動物行動装置に組み込むことができます。 このアプローチのスケーラブルな特徴は、より大型の動物モデルや人間への将来のアプリケーションに最適です。 さらに、酸化鉄磁性ナノ粒子は磁気共鳴画像法 (MRI) の造影剤としてすでに臨床的に承認されています 6。 この研究で使用された酸化鉄磁性ナノディスクは、臨床的に承認されたナノ粒子と同様の化学的性質を持っています。 したがって、この研究は、磁気機械刺激を備えたトランスジーンフリーのリモート DBS における重要な概念実証であり、ヒト患者に対する将来のトランスレーショナル アプリケーションの開発に有望であることを示しています。

ナノディスクの合成プロセスは、以前の研究で説明されたプロトコルに従います11。 合成プロセスは 2 つのステップで構成されます。 まず、10 ml 99.5% エタノール、0.6 ml ddH2O (またはより小さいナノディスクの場合は 0.8 ml ddH2O)、0.8 g の無水酢酸ナトリウム (Sigma-Aldrich) および 0.273 g の FeCl3・6H2O (Sigma-Aldrich) を混合することによって、ヘマタイト ナノディスクを合成しました。 。 混合物を撹拌して均質化した後、混合物をテフロン（登録商標）で裏打ちされた鋼製容器に移し、密封した。 容器をオーブン内で180℃で18時間加熱した。 ヘマタイトナノディスクをddH2Oで2回洗浄した。 次に、ナノディスクをエタノールで２回洗浄した。 ナノディスクは真空デシケーター内で乾燥されました。 ヘマタイト ナノディスクはさらにマグネタイト ナノディスクに変換されるか、対照実験に使用されました。 還元のために、1 mgのヘマタイトナノディスクを20 mlのトリオクチルアミン（Acros Organics）および1 gのオレイン酸（Sigma-Aldrich）と混合した。 混合物をシュレンクラインに接続された三口フラスコに入れ、H2 (95% アルゴンを含む 5%、Chiah Lung) および N2 (99.9%、Chiah Lung) の雰囲気中で 370 °C で 25 分間加熱しました。 還元中に、赤色のヘマタイト ナノディスクは濃い灰色に変わりました。 冷却後、ディスクをヘキサン（Alfa Aesar）で洗浄した。 次に、マグネタイト ナノディスクをクロロホルム (JT Baker) に分散させ、ガラスバイアルに入れて 4 °C で保存しました。

MND と HND は両方とも PMAO コーティングで機能化されています。 PMAO コーティングの前に、クロロホルム中のナノディスクを真空デシケーター内で乾燥させました。 まず、１０ｍｇの分子量３０，０００のＰＭＡＯ（４１９１１７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍｌのクロロホルムに溶解した。 乾燥した１ｍｇのＭＮＤまたはＨＮＤ粉末をＰＭＡＯ含有クロロホルムに添加した。 ナノディスクが十分に懸濁されるまで、混合物を１時間超音波処理した。 次に、PMAO でコーティングされたナノディスクを真空デシケーター内で一晩乾燥させました。 乾燥したナノディスクを、２５％（ｗ／ｖ）の濃度でＴＡＥ緩衝液（トリス酢酸塩ＥＤＴＡ、Ｂｉｏｍａｔｅ）に添加した。 混合物を80℃で3時間超音波処理した。 超音波処理後、8500 rpmで10分間微量遠心分離機を使用してペレット化しました。 上清を除去し、ddH2Oを再充填した。 十分な超音波処理から ddH2O の再充填までのプロセスを 3 回繰り返しました。 脳スライス内のナノディスクを視覚化するために、200μlのニュートラアビジン（Thermo Scientific）と200μlのAlexa Fluor 594色素（Thermo Scientific）を2時間混合することによって、蛍光標識PMAOコーティングされたMNDを調製しました。 次に、10 mg の MND をニュートラアビジンと色素の混合物に 2 時間添加しました。

クロロホルム中のナノディスクを真空デシケーター内で乾燥させた後、ddH2Oに溶解しました。 水性ナノディスクを銅グリッド (Ted Pella Inc.) 上に置き、透過型電子顕微鏡 (TEM) を使用してディスクの形態を視覚化しました。 TEM は、Chang Gung Memorial Hospital (CGMH) の顕微鏡コア研究室で HT7800 (Hitachi) を使用して実施されました。 ナノディスクの直径と厚さは、TEM 画像から ImageJ によって測定されました。各六角形のナノディスクは 3 つの対角線で描かれ、最長の距離が 1 つのナノディスク直径測定値として選択されました。 ナノディスク粉末は X 線回折 (XRD) によって検出され、材料の構造が確認されました。 XRDは、国立清華大学（NTHU）の計測センターによりXtaLAB Synergy DW（リガク）を使用して実行されました。 ヘマタイトまたはマグネタイトを N グリース (Apiezon) と混合し、100 K でグラファイト単色 Mo Kα 放射線 (λ = 0.71073 Å) を使用する HyPix-Arc 150° 湾曲ハイブリッド フォトン カウンティング X 線検出器に接続された MicroMeshesTM (MiTeGen) 上に収集しました。ナノディスクの飽和磁化 (Ms) を研究するために、振動サンプル磁力計を使用して ± 9 kOe の範囲のヒステリシス曲線を測定しました。 ナノディスクの磁気モーメントは、国立成功大学の中核施設センター (NCKU) の MPMS SQUID 振動サンプル磁力計 (VSM; Quantum Design) を使用して測定されました。 さらに、NTHU の計測センターによって実行された磁気モーメントの計算のための鉄元素濃度の定量化には、Agilent 725 誘導結合プラズマ発光分光計 (ICP-OES) が使用されました。 磁気モーメントの計算には、以前の研究で述べた式に従いました11。

μは磁気モーメントです。 V は、TEM から測定されたナノディスクの体積です。 ρ はマグネタイト (Fe3O4)11 の密度です。 Ms は、VSM から測定される飽和磁化です。 MND の磁気モーメントは次のとおりです。

潜在的な特性を検出するために、ddH2O に溶解した PMAO でコーティングされたナノディスクが使用されました。 ゼータ電位は、DelsaTM Nano C Particle Analyzer (Beckman Coulter) を用いた電気泳動光散乱によって測定されました。 ３．５μｌの２０ｍｇ／ｍｌ ＰＭＡＯコーティングナノディスクを、７日目のインビトロ（ＤＩＶ）で１５分間海馬ニューロンにロードして、細胞膜上にナノディスクを付着させた。 次いで、１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して、ＣＧＭＨによって作製された固定緩衝液（０．１Ｍカコジル酸緩衝液中の３％グルタルアルデヒド、２％パラホルムアルデヒド）で３回洗浄する。 固定サンプルは、電界放射型走査型電子顕微鏡 (FE-SEM) を使用してニューロンに付着したナノディスクを記録するまで、4 °C の冷凍庫に保管しました。 FE-SEM は、CGMH の顕微鏡コア研究所によって SU8220 (Hitachi) を使用して実行されました。 FE-SEM を使用して、ニューロンに付着するナノディスクを 2,000 倍の倍率で記録し、ナノディスクの表面特徴を 30,000 倍の倍率で記録しました。

すべての動物実験手順は、国立陽明交通大学 (NYCU) の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました。 すべての妊娠した Sprague-Dawley ラットは LASCO から購入されました。 出生後 (<3 日) の Sprague-Dawley ラットの子を海馬の初代培養に使用しました。 海馬を冷却解剖溶液（１６０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、４ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５．５ｍＭグルコース、ｐＨはＮａＯＨにより７．４に調整した）中で抽出した。 抽出後、2 ～ 3 匹の子犬の海馬を混合し、予熱した消化溶液 (1 mM L-システイン、0.5 mM EDTA、1 mM CaCl2、1.5 mM NaOH、および 10 単位/ml パパイン (76220、Sigma-Aldrich)) に移しました。 。 混合物を37℃で25分間インキュベートした。 パパインは、消化溶液を除去し、最小必須培地（MEM）中の不活化溶液（0.25% ウシアルブミンおよび 0.25% トリプシン阻害剤）、0.4% D-グルコース、および 5% ウシ胎児血清（6140079、Gibco）中で組織をインキュベートすることによって不活化されました。アール塩あり、L-グルタミンなし; 11090-081、Gibco)、37 °C、2 分間。 不活化溶液を除去した後、組織を血清培地（0.4% D-グルコース、および L-グルタミンを含まないアール塩を含む MEM 中の 5% ウシ胎児血清）中で、ファイアーポリッシュガラスピペット（111096、Kimble）を用いて粉砕した。 解離した細胞をセルドレイナー (93070、SPL) でろ過し、播種前に血清培地中で 37 °C でインキュベートしました。 計数後、24 ウェル プレート内のマトリゲル (354234、Corning) でコーティングされた 12 mm カバースリップ上に細胞をウェルあたり約 110,000 個の細胞で播種しました。 海馬細胞は、B27 サプリメント (17504-044、Gibco) および GlutaMAX (35050-061、Gibco) を含む神経基礎培地 (10888-022、Gibco) で培養されました。 インビトロ（ＤＩＶ）３日目に、２０μｌの有糸分裂阻害剤（５－フルオロ－２'－デオキシウリジン、Ｓｉｇｍａ；神経基礎培地中４μＭ）を添加して、グリア細胞を阻害した。 すべてのイメージングと刺激は DIV 5 ～ 14 で実行されます。

DIV 7-14 の初代培養海馬ニューロンをパッチクランプ電気生理学的記録に使用しました。 全細胞記録は、MultiClamp 700B (Molecular Devices, LLC, USA) を使用し、正立顕微鏡 (Scientifica, EN) の下で取得しました。 データは、Clampex 11.1 ソフトウェア (Molecular Devices) によって制御される Digidata 1550B インターフェイス (Molecular Devices) を使用して 5 kHz でフィルター処理され、10 kHz でサンプリングされ、Clampfit 11.2 (Molecular Devices) を使用して分析されました。 記録は室温で行われました。 ピペット抵抗が 3 ～ 10 MΩ のガラス ピペットは、ホウケイ酸ガラス (Harvard Apparatus、米国) から引き抜かれました。 内部溶液は、７４ｍＭ ＫＣｌ、７０ｍＭ グルコン酸Ｋ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ、１０ｍＭ ＨＰＥＰＳおよび７ｍＭ Ｎａ２－ホスホクレアチンを含有し、ＫＯＨによりｐＨ７．３に調整された。 細胞外タイロード溶液は、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ ２ 、２ｍＭ ＣａＣｌ ２ 、２５ｍＭ ＨＰＥＰＳおよび５１ｍＭ Ｄ－グルコースを含み、ＮａＯＨによりｐＨ７．３に調整された。 慣らし運転を行って全細胞記録を行った後、各ニューロンの静止膜電位を直ちに測定しました。 記録時のシール抵抗は３～１０ＭΩであった。 Rheobase は、複数の活動電位をトリガーできる最小 1 秒の電流ステップでした。 入力抵抗は、-50 pA の電流ステップで 1 秒間記録されました。 入力抵抗は、ベースラインと電流印加の最後の 100 ms の間の電圧差から測定されました。

培養細胞のすべての Ca2+ イメージング用に、タイロード溶液 (125 mM NaCl、2 mM KCl、2 mM MgCl2、2 mM CaCl2、25 mM HEPES、51 mM D-グルコース (Sigma-Aldrich)) を調製しました。 Fluo-4 Ca2+ イメージング キット (Invitrogen) を培養ニューロンの Ca2+ 応答の測定に使用しました。 Fluo-4 イメージングのプロトコールは Invitrogen によって示されました。 ニューロンは、Fluo-4 溶液 (1 mM) 中で 15 ～ 30 分間インキュベートされ、その後、イメージングのために Fluo-4 を含まないタイロード溶液に移されました。 ２０ｍｇ／ｍＬの濃度の３．５μｌのマグネタイトナノディスクまたはヘマタイトナノディスクを、２４ウェルプレート中の４９６．５μＬの溶液とともに各ウェルに添加した。 ナノディスクの最終濃度は 70 μg/ウェルです。 5分間のインキュベーション後、海馬ニューロンを含むカバースリップを、蛍光顕微鏡(SS-1000-00、Scientifica)下で磁場を印加するためのカスタムステージに移した。 Fluo-4イメージングには、当社の光源(LEDD1B)、Hamamatus C13440カメラ、GFPフィルターキューブ(39002、Chroma)を使用しました。

Ca2+ 活性ビデオは、HCImage ソフトウェア (Hamamatsu) を使用して、「.avi」形式で正立蛍光顕微鏡 (SS-1000-00、Scientifica) で収集されました。 ビデオのフレームレートは 1 Hz でした。 ビデオは、opencv2 に基づいたカスタム Python スクリプトで処理されました。 numpy に基づくカスタム Python スクリプトは、以前の研究 11 のアルゴリズムを適用することにより、蛍光強度を ΔF/F0 に変換するために使用されました。 アルゴリズムやPythonスクリプトの詳細は補足に記載しています。 活性化されたセルは、指定された期間で 10% を超える最大 ΔF/F0 を持つセルによって定義されました。 各培養サンプルの細胞活性率は、活性化細胞数を総細胞数で割ったパーセンテージによって定義されました。 カスタム スクリプトの詳細については、補足情報を参照してください。

Ca2+ を含まないタイロード溶液 (125 mM NaCl、2 mM KCl、2 mM MgCl2、2.5 mM EGTA、25 mM HEPES、51 mM D-グルコース (Sigma-Aldrich)) を Ca2+ フリー実験用に調製しました。 ＴＲＰＣファミリー阻害剤ＳＫＦ−９６３６５（Ｔｏｃｒｉｓ）を、５０μＭの濃度でＣａ２＋を含むタイロード溶液に添加した。 ＴＲＰＶ４特異的阻害剤ＨＣ−０６７０４７（Ｓｉｇｍａ）を１μＭの濃度でタイロード溶液に添加した。 テトロドトキシン (TTX) ナトリウム チャネル ブロッカー (Abcam) を 100 nM の濃度でタイロード溶液に添加しました。 ＴＲＰＣ１／６およびピエゾ１特異的阻害剤ＧｓＭＴｘ４（アブカム）を５μＭの濃度でタイロード溶液に添加した。 TRPC 1/6 および piezo2 特異的阻害剤 D-GsMTx4 (Tocris) を 5 μM の濃度で Tyrode 溶液に添加しました。 ＴＲＰ阻害剤２−ＡＰＢ（Ｔｏｃｒｉｓ）を１００μＭの濃度でタイロード溶液に添加した。 薬理学実験では、イメージングの前に、培養細胞を Fluo-4 を含むタイロード溶液から上記の溶液に 5 分間以上移しました。

すべての動物実験は、NYCU の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って、NYCU IACUC によって承認されました。 すべてのマウスは LASCO から購入しました。 マウスは実験前にNYCU実験動物センターで12時間の明暗サイクル下で維持された。 生後 8 ～ 12 週目の C57BL/6 雄マウスをすべての in vivo 実験に使用しました。 1 mg/ml の PMAO コーティングされたマグネタイトおよびヘマタイト ナノディスクを STN に片側的に注入しました (AP: -2.06、ML: -1.5、DV: -4​​.5)。 ＰＢＳ中の合計２μｌのナノディスクを、微量注入シリンジ（７８０３－０５、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）および微量ポンプ（Ｋｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して注入した。 頭蓋手術後、術後の痛みを軽減するために、0.2 ml のカルプロフェン (PHR1452、Sigma-Aldrich) を 0、24、48 時間の時点で皮下注射によりマウスに与えました。

c-fos 染色では、ナノディスクを注入した C57BL/6 雄マウスを、ナノディスク注入の 5 ～ 7 日後に in vivo で磁気刺激するための特注コイル内に配置しました。 磁気刺激の90分後にマウスを屠殺した。 TRPCの染色には、磁気刺激を与えていないC57BL/6雄マウスを使用した。 蛍光標識ＭＮＤを染色するために、ＳＴＮで蛍光標識ＭＮＤを注射した同日または５日後にＣ５７ＢＬ／６雄マウスを屠殺した。 ＰＢＳ中の４％ＰＦＡによる経頭蓋灌流後に、すべての脳を回収した。 冠状脳切片を、振幅０．５、周波数５０Ｈｚのビブラトーム（５１００ＭＺ、Ｃａｍｄｅｎ）によってスライスした。 免疫染色用の切片の厚さは50μmでした。 蛍光標識された MND を含むスライスの厚さは 150 μm でした。 脳スライスをＰＢＳで５分間３回洗浄し、スライスを２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１５分間透過処理した。 バックグラウンドを 2% Triton-X-100、30% H2O2、およびメタノールで 10 分間除去しました。 スライスをＰＢＳで３回洗浄した後、室温で９０分間、ＰＢＳ中の３％正常ヤギ血清によってスライスをブロックした。 スライスをＰＢＳで３回洗浄した。 免疫染色では、スライスを、1:750 ウサギ抗 c-Fos モノクローナル抗体 (9F6#2250、Cell signaling)、1:150 マウス抗 NeuN 抗体 (クローン A60、#MAB377、MERCK) を含む 1 次抗体溶液でインキュベートしました。 :200 抗ウサギ NeuN (MABN140、Sigma-Aldrich)、1:100 抗ウサギ TRPC1 (SI-T8276、Sigma-Aldrich)、1:500 抗マウス TRPC5 (N67/15、NeuroMab)、1:100 抗- ウサギ TRPC6 (AB5574、MERCK)、PBS 中の 1% 正常ヤギ血清および 2% Triton-X 100。 スライスを 4 °C で 16 ～ 18 時間インキュベートしました。 PBSでスライスを3回洗浄した後、スライスをPBS中で対応する二次抗体（1:500ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488（ab150113、Abcam）および1:500ヤギ抗マウスAlexa Fluor 594（ab150116、Abcam））とともにインキュベートしました。アブカム））。 すべてのスライスは、マウントする前に PBS で 3 回洗浄されました。 ＤＡＰＩ（ＧＴＸ３０９２０、Ｇｅｎｅｔｅｘ）を含む封入媒体によって、スライスをガラス顕微鏡スライド上に載せた。 撮影には倒立蛍光顕微鏡（DMI3000、Leica）、正立蛍光顕微鏡（SS-1000-00、Scientifica）、LED光源（pE300、CoolLED）、浜松ホトニクスC13440カメラ、フィルターキューブ（39000、19008、31002、Chroma）を使用。

コイルは、18 AWG 自己融着銅線 (SBWR、Chientai) を 2000 回巻いた空芯コイルでした。 コイルの抵抗は 7 Ω、インダクタンスは 60 mH でした。 1 Hz の変動する磁場刺激では、10 ～ 50 mT の刺激に 0.6 A ～ 2.8 A が使用されました。 5 Hz の磁気刺激で​​は、10 ～ 50 mT の刺激に 0.6 A ～ 2.9 A が使用されました。 10 Hz の磁気刺激で​​は、10 ～ 50 mT の刺激に 0.6 A ～ 3 A が使用されました。 20 Hz の磁気刺激で​​は、10 ～ 50 mT の刺激に 0.7 A ～ 3.2 A が使用されました。 カスタムメイドの H ブリッジ ドライバーを使用して、コイルでさまざまな磁場を生成しました。 H ブリッジは、2 つの p チャネル MOSFET (IRF4905、International Rectifier) と 2 つの n チャネル MOSFET (IRF3710、International Rectifier) で構成されています。 これら 4 つの MOSFET に加えて、さらに 2 つの n チャネル MOSFET を使用して、H ブリッジ内の P チャネル MOSFET を制御しました。 動作電圧の範囲は、2 組の抵抗と MOSFET のパラメータによって制御されます。 異なる抵抗やMOSFETを交換することで回路を簡単に変更できます。 関数発生器 (33210 A、Keysight) を使用して、± 5 V 方形波を生成しました。 関数発生器からの信号は、電圧フォロワとインバータ (TLC2272、Texas Instrument) を通過しました。 ボルテージフォロワとインバータのゲインは 1 に等しくなります。 ボルテージフォロアとインバータからの信号の位相は180°異なります。 各信号はフルブリッジ ドライバーのハーフブリッジを制御します。 カスタムメイドの H ブリッジ ドライバーのオペアンプには内部電源 (PS-3030DF モデル、LONGWEI) が使用されました。 コイル内に磁場を生成するために外部電源 (IT6721、ITECH) を使用しました。

コイルによって生成される磁場を評価するには、有限要素法磁気​​ソフトウェア (バージョン 4.2) を使用して、コイルの磁場を 2D でシミュレートします (図 2d、5c)。 プログラム設定ではFEMM4.2の磁気問題モードと平面構成を使用しました。 銅線 (12 または 18 AWG) と空気のパラメーターは、FEMM4.2 の材料ライブラリーから取得しました。 コイル内の磁界測定にはガウスメーター（TM801、KANETEC）を使用した。 アキシャルプローブは、コイル内部に発生する磁場を検出するために使用されました。

複数の磁気機械的刺激による初代培養ニューロンの死滅は、ヨウ化プロピジウム (PI; P1304MP、Invitrogen) を用いて測定されました。 Fluo-4 を使用して初代培養ニューロンの Ca2+ 応答をイメージングした後、PI を細胞外溶液に添加して、最終濃度 120 μM を達成しました。 5分後、蛍光顕微鏡(SS-1000-00、Scientifica)を使用して、Fluo-4およびPIの蛍光を画像化した。 当社の光源 (LEDD1B)、Hamamatus C13440 カメラ、フィルターキューブ (39002 および 39010、Chroma) を使用しました。

生体内でのワイヤレス神経刺激のための均一な磁場を生成します。 4 つのカスタムメイドの空芯コイルを in vivo 実験に使用しました。 各コイルには 12 AWG 銅線が 500 回巻かれています。 各コイルの抵抗とインダクタンスはそれぞれ 1.02 ～ 1.55 Ω、22 ～ 31.6 mH です。 図 6 に示すように、4 つのコイルが 2 つのペアに分離され、互いに積み重ねられます。 コイル間の隙間は4cmです。 各コイルのドライバーにはフルブリッジモジュール（AQMH3615NS、AKELC）を使用しました。 ドライバーは、Arduino UNO (Arduino) によって生成された 5 V 方形波によって制御されました。 Arduino ボードは、Arduino IDE を使用したカスタム スクリプトによって制御されました。 Arduinoコードの詳細は補足に記載しました。 内部電源は 5 V で、フルブリッジモジュールに動作電圧を与えるために Arduino によって供給されます。 コイルへの電流供給には外部電源（HJS-1000モデル、HuntKey）を使用しました。 インビボ実験用のコイル内に 10 Hz で 50 mT の均一な磁場を生成するために、10 A の電流が使用されました。

すべての動物は、磁気刺激の前に少なくとも 45 分間行動室に慣れました。 シリンダーアリーナは内径 20 cm、高さ 16 cm のポリメチルメタクリレートで作られ、特注の磁気装置内に収まりました。 覚醒したマウスをコイルの中心にあるシリンダーアリーナに置き、上からカメラで記録しました。 刺激の前に、磁場を適用しない 5 分間の前刺激期間があり、その後 10 分間の磁気刺激期間が続きます。 磁気刺激期間では、交流磁場 (10 Hz で 50 mT) による 30 秒の刺激と、磁場のない 30 秒の刺激間間隔を 10 回適用しました。 この磁気刺激プロセスは、c-fos によるニューロン活動の調査と回転行動テストに使用されました。 以前に報告された DeepLabCutTM (DLC)48 は、記録された行動ビデオ内のマークレス マウスを追跡するために使用されました。 回転動作の分析には、カスタムメイドの Python コードが使用されました。 詳細な説明とスクリプトについては、補足メソッドを参照してください。

すべての統計は JASP (v0.14.1.0、JASP チーム) で実行されました。 ドット プロット内のすべての誤差バーは、平均の標準誤差 (sem) を示します。 蛍光変化の痕跡における灰色またはピンク色の領域はすべて、平均の標準誤差 (sem) を示します。 Wilcoxon 符号付き順位検定は、ペアのデータを比較するために使用されました。 対になっていないものを比較するために、Wilcoxon 順位和検定を使用しました。 Tukey 事後検定と二元配置分散分析を使用して、2 つの因子を含むデータを比較しました。 複数のグループのデータを比較するために、ダン事後検定とクラスカル-ウォリス検定を使用しました。 各実験の個々の細胞、サンプル (個々の培養物)、および動物の数は、図と表の凡例に示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

現在の研究で使用されている数値の基礎となるソース データは補足データ 1 に提供されています。その他すべてのデータは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

この研究に関連するコードは、補足情報の「方法」セクションで入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

材料とエレクトロニクスに関するアドバイスをいただいた P. Ankieeva、D. Gregurec、および F. Koehler に感謝します。 この研究は、台湾 (中華民国) 科学技術省 (MOST) (108-2636-B-009-006; 109-2636-B-009-008; 110-2636-B-A49-003) の資金提供を受けています。

これらの著者は同様に貢献しました: Chih-Lun Su、Chao-Chun Cheng。

台湾、新竹市、国立陽明交通大学生体医工学研究所

スー・チールン、チェン・チャオチュン、イェン・ピンシャン、ファン・ジュンシュアン、イェン・ジン・ティン、チェン・ポーハン

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概念化: PHC、CLS 方法論: PHC、CLS、CCC、PHY、JXH 調査: CLS、CCC、PHY、JXH、YJT 形式分析: CLS、CCC、JXH、YJT 可視化: CLS、CCC、PHY、JXH、YJT、PHC資金獲得：PHC プロジェクト運営：PHC 監修：PHC 執筆―原案：PHC 執筆―査読・編集：PHC、CLS、CCC、PHY、JXH、YJT

ポーハン・チアン氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献した Rahul Srinivasan 氏と Xiaoming Jin 氏に感謝します。 主な編集者:エリアナ・シームズとジーン・チョン。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

スー、CL、チェン、CC、イェン、PH。 他。 固有の TRPC 媒介磁気機械刺激による in vitro および in vivo のワイヤレス神経調節。 Commun Biol 5、1166 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04124-y

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受信日: 2022 年 2 月 14 日

受理日: 2022 年 10 月 17 日

公開日: 2022 年 11 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04124-y

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